在水存在時(shí)，即樣品中的水與卡爾費休試劑中的SO2與I2產(chǎn)生氧化還原反應。
I2 + SO2 + 2H2O → 2HI + H2SO4
但這個(gè)反應是個(gè)可逆反應，當硫酸濃度達到0.05%以上時(shí)，即能發(fā)生逆反應。如果我們讓反應按照一個(gè)正方向進(jìn)行，需要加入適當的堿性物質(zhì)以中和反應過(guò)程中生成的酸。經(jīng)實(shí)驗證明，在體系中加入吡啶，這樣就可使反應向右進(jìn)行。
3 C5H5N+H2O+I2+SO2 → + 硫酸酐吡啶
生成硫酸酐吡啶不穩定，能與水發(fā)生反應，消耗一部分水而干擾測定，為了使它穩定，我們可加無(wú)水甲醇。
硫酸酐吡啶 + CH3OH（無(wú)水） → 甲基硫酸吡啶
我們把這上面三步反應寫(xiě)成總反應式為：
I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH → 2吡啶+甲基硫酸吡啶
從反應式可以看出1mol水需要1mol碘，1mol二氧化硫和3mol吡啶及1mol甲醇而產(chǎn)生2mol吡啶、1mol甲基硫酸吡啶。這是理論上的數據，但實(shí)際上，SO2、吡啶、CH3OH的用量都是過(guò)量的，反應完畢后多余的游離碘呈現紅棕色，即可確定為到達終點(diǎn)。
I2︰SO2︰C5H5N = 1︰3︰10
2、卡爾費休試劑的配制與標定
若以甲醇作溶劑，則試劑中I2、SO2、C5H5N（含水量在0.05%以下）三者的克分子數比例為：I2︰SO2︰C5H5N = 1︰3︰10
這種試劑有效濃度取決于碘的濃度。新配制的試劑其有效濃度不斷降低，其原因是由于試劑中各組分本身也含有一些水分，但試劑濃度降低的主要原因是由一些副反應引起的，較高消耗了一部分碘。
這也說(shuō)明了配制這種試劑要單獨配，分甲乙兩種試劑并且分別貯存，臨用時(shí)再混合，而且要標定。但我國市場(chǎng)上使用的卡爾費休水份測定試劑，無(wú)論是單組份的，還是雙組份的一般都由廠(chǎng)家已經(jīng)調配好的可直接使用產(chǎn)品，但由于卡爾費休試劑是一種很不穩定的混合物質(zhì)，因此用戶(hù)在使用時(shí)都必須進(jìn)行標定，以測定其真實(shí)的水當量數據。
卡爾費休法測定水份，需要注意如下幾點(diǎn)：
① 此法適用于多數有機樣品，包括食品中糖果、巧克力、油脂、乳糖和脫水果蔬類(lèi)等樣品；
② 樣品中有強還原性物料，包括維生素C的樣品不能測定；樣品中含有酮、醛類(lèi)物質(zhì)的，會(huì )與試劑發(fā)生縮酮、縮醛反應，必須采用的醛酮類(lèi)試劑測試。對于部分在甲醇中不溶解的樣品，需要另尋合適的溶劑溶解后檢測，或者采用卡氏加熱爐將水份汽化后測定。
③ 卡爾費休法不僅可測得樣品中的自由水，即此法測得結果更客觀(guān)地反映出樣品中總水分含量。
④ 固體樣品細度以40目為宜，用粉碎機而不用研磨，防止水分損失。